Adres siedziby:
ul. Sarego 2
31-047 Kraków
tel. 12 422 88 52
fax 12 422 80 65
Adres do korespondencji:
ul. Krakowska 1
32-083 Balice k. Krakowa
tel. (Centrala) 12 357 25 00
tel. (Sekretariat) 12 357 27 00
fax 12 285 67 33
Dzisiaj jest: piątek, 17 listopada 2017 20:24:32
Odwiedziło nas: 8430126 gości (dzisiaj: 1502, wczoraj: 1569)
Prace badawcze w 2009 roku

Temat 3337.1

"Nowe nośniki egzogennego DNA w badaniach nad integracją i ekspresją genów w geno-mach zarodków królika i kozy."

Autorzy: dr inż. J. Jura

Opis

Celem tematu było opracowanie i porównanie transfekcji zygot królika i kozy za pomocą wektorów nowej generacji metodą bezpośredniego transferu DNA (klasyczna mikroiniekcja), a efektywnością nośnika z Agrobacterium (kompleks T-4 DNA).

Przygotowano i zastosowano konstrukcję genową ekspresyjną CMV ZF (pcDNAZ-C3H12A-rfp (MC-PiP),. zawierającą promotor wirusowy CMV.

Zastosowano również konstrukcje genową referencyjną- wektor markerowy CMV RFP (pcDNAZC3H-rfp).

Przeprowadzono prace mające na celu przygotowanie kompleksów T-4 DNA do transfekcji zygot królika. W ramach tych prac uzyskano nośnik T-4 DNA wyizolowany z Agrobacterium. Po oczyszczeniu i zsekwencjonowaniu, uzyskano kompleks T-4 połączony z DNA genu pcDNAZC3H12A. Uzyskany kompleks testowano na linii komórek somatycznych w celu sprawdzenia czy utworzony kompleks wprowadza określoną informację genetyczną do genomu transformowanych komórek. Przeprowadzone badania wykazały, iż kompleks T-4 DNA jest skuteczny w transfekcji komórek somatycznych hodowanych in vitro. Kompleks T-4 wprowadzony metodą „subzonal-injection” okazał się nieskuteczny w transformacji zygot króliczych.

Badania nad integracją i ekspresją przeprowadzono na 1250 zygotach króliczych uzyska-nych od 85 samic dawczyń. Poddane mikroiniekcji zygoty hodowano do stadium 8-16 komórek oraz do stadium blastocysty oceniając tempo rozwoju oraz odsetek uzyskanych odpowiednich stadiów rozwojowych w odniesieniu do kontroli (zygoty nie poddane mikroiniekcji). Ekspresje sprawdzano pod mikroskopem fluorescencyjnym. W przypadku wektora RFP poziom ekspresji wyniósł 16.8%, a w przypadku wektora ZF - 6,7% i dotyczył tylko zarodków, których proces podziałowy został zahamowany.

Do mikroiniekcji zygot kozich zastosowano nowy wektor wyposażony w gen markerowy o wzmocnionym sygnale - WAP-h Alb eGFP.

W pierwszym etapie poddane mikroiniekcji zygoty kozie hodowano do stadium 4 komórkowego i oceniano ekspresję pod mikroskopem fluorescencyjnym. Następnie, zarodki, u których stwierdzono sygnał (zarodki „transgeniczne”) przenoszono do osobnej hodowli i hodowano do stadium blastocysty (96 godz.). Grupę kontrolna stanowiły pozostałe zarodki, u których nie stwierdzono ekspresji wprowadzonego wektora, umieszczone w oddzielnej hodowli. Mikroiniekcji poddano 49 zygot kozich. Ekspresję wprowadzonego genu stwierdzono u 6 zarodków 4- komórkowych uzyskanych z zygot poddanych mikroiniekcji WAp-hAlbeGFP. Uzyskany poziom ekspresji w tym przypadku (zarodki 4-komórkowe) wyniósł 12,2%. Po pięciu dniach hodowli przeprowadzono ponowną ocenę. Rozwój „transgenicz-nych” zarodków 4-komórkowych został zablokowany – nie stwierdzono dalszych podziałów; potwierdzono emisję sygnału.. Natomiast w obrębie zarodków kontrolnych (stwierdzony brak ekspresji) uzyskano 9 (21%) zarodków w stadium blastocysty.

Uzyskane w badaniach rezultaty wykazały wysoką przydatność stosowania nowej generacji genów markerowych do oceny ekspresji wprowadzanych genów. Gen kodujący białko GFP o wzmocnionym sygnale (e-gfp) jak i gen kodujący białko RFP (gen rfp) podłączony do określonej konstrukcji genowej, pozwalają na szybkie, bo już po 48 godzinach od transfekcji, stwierdzenie ekspresji wprowadzonego genu. Ma to istotne przełożenie na podniesienie efek-tywności procesu transgenezy, a ponadto pozwala na prowadzenie badań związanych z wpływem wprowadzanego genu na rozwój zarodkowy, jego tempo i stwierdzenie efektów negatywnych (np. zahamowanie rozwoju na określonym stadium rozwojowym).

Powrót do wszystkich tematów

 
© 2008-2017 Instytut Zootechniki PIB (National Research Institute of Animal Production)
Koło Wędkarskie PZW w Oleśnicy pzw.wolesnicy.info - Strona Koła Wędkarskiego w Oleśnicy (świętokrzyskie)
Odpowiedz na wyzwania (konkursy), głosuj, wygrywaj nagrody

Ta strona używa cookies i podobnych technologii. Szczegóły znajdziesz w Polityce Prywatności.