Adres siedziby:
ul. Sarego 2
31-047 Kraków
tel. 12 422 88 52
fax 12 422 80 65
Adres do korespondencji:
ul. Krakowska 1
32-083 Balice k. Krakowa
tel. (Centrala) 12 357 25 00
tel. (Sekretariat) 12 357 27 00
fax 12 285 67 33
Dzisiaj jest: czwartek, 23 listopada 2017 10:11:28
Odwiedziło nas: 8444067 gości (dzisiaj: 842, wczoraj: 2138)
Prace badawcze w 2012 roku

Zadanie 02-2.00.1

"Transgeneza zwierząt gospodarskich dla hodowli i biomedycyny"

Cel zadania

rozwój metod, uzyskiwanie i hodowla transgenicznych zwierząt gospodarskich

Opis

Kontynuowano badania nad opracowaniem nowych metod trensfekcji zygot. Uzyskano 287 zygot króliczych od 22 stymulowanych hormonalnie samic dawczyń. 188 zygoty poddano zabiegowi elektroporacji wektorem P12-eGFP. Zabieg elektroporacji przeprowadzono na urządzeniu AMAXA, stosowanym do transfekcji komórek somatycznych. Przed zabiegiem elektroporacji wektor wprowadzono do przestrzeni okołożółtkowej zygot w stężeniu 2µg/µl (78 zygot) oraz 500 ng/µl (154 zygoty), stosując postępowanie wypraktykowane w metodzie lipomikroiniekcji. Po wprowadzeniu wektora zygoty umieszczano w płynie PBS uzupełnionym 10% dodatkiem FCS i przeniesiono do jednorazowej kuwety elektroporacyjnej. 30 zygot (2µg/µl DNA) transfekowano programem A-023 stosowanym dla embrionalnych komórek macierzystych myszy oraz 30 zygot ((2µg/µl DNA) ) programem A-024 stosowanym dla embrionalnych komórek macierzystych myszy z podwyższonymi parametrami pola elektrycznego. 53 zygoty (500ng/µl DNA) transfekowano programem U-030 stosowanym dla komórek mezenchymalnych, 51 zygot (500ng/µl DNA) programem X-001 stosowanym dla linii komórek JURKAT ( komórki o bardzo wrażliwe na bodźce pola elektrycznego oraz 50 zygot (500ng/µl) programem W-001 (program dla embrionalnych komórek macierzystych szczura). Po transfekcji zygoty hodowano in vitro przez okres 48 godzin -do stadium 16 komórkowego. Po hodowli zarodki poddano analizie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Proces elektroporacji spowodował zahamowanie rozwoju zarodków i ich degenerację. Najmniejszy stopień uszkodzeń cytoplazmy odnotowano po zastosowaniu programu transfekcji X-001, gdzie stwierdzono rozwój 8 zarodków do stadium 16-komórkowego. Badanie fluorescencyjne nie wykazało ekspresji wprowadzonego genu.

Celem planowanych badań dotyczących uzyskiwania transgenicznych świń jest opracowanie alternatywnych dla mikroiniekcji metod wprowadzania egzogennej informacji genetycznej. W okresie sprawozdawczym wyselekcjonowano 20 świń dawczyń zygot do transfekcji. Równolegle przygotowano 10 loszek potencjalnych biorczyń zarodków poddając je (5 loszek) standardowej synchronizacji rui. Dawczynie w liczbie 10 poddano superowulacji stosując standardowy protokół postępowania stosowany u tego gatunku. Zygoty do transfekcji uzyskiwano przyżyciowo poprzez przepłukiwanie jajowodów 4 loszek 20ml płynu PBS uzupełnionego 10% dodatkiem albuminy bydlęcej. Następnie płyn przeszukiwano pod mikroskopem stereoskopowym w celu wyszukania i oceny morfologicznej komórek jajowych. Wyszukane komórki jajowe poddawano procesowi wirowania w celu wizualizacji przedjądrzy – 16000g/5min. Odwirowane komórki jajowe przenoszono do komory manipulacyjnej wypełnionej płynem PBS uzupełnionym 20% dodatkiem FCS i umieszczano pod mikroskopem odwróconym. Materiał ponownie poddawano ocenie w celu stwierdzenia czy komórki są zapłodnione. Zapłodnione komórki jajowe (zygoty) poddawano procesowi transfekcji określonym genem stosując zabieg mikroiniekcji DNA do jednego z uwidocznionych przedjądrzy. W wyniku przeprowadzonych eksperymentów uzyskano 94 komórki jajowe, które zamierzano przeznaczyć do transfekcji genem P12. Po wstępnej ocenie morfologicznej komórki jajowe poddano wirowaniu. Po przeniesieniu do komory manipulacyjnej i ocenie pod mikroskopem odwróconym, nie stwierdzono ciałek kierunkowych oraz uwidocznionych przedjądrzy. W związku z czym nie poddano ich procesowi transfekcji. Komórki przeniesiono do pożywki i poddano hodowli pozaustrojowej w celu zweryfikowania powodu braku uwidocznienia w nich przedjądrzy. Po 48 godz. poddano je ocenie nie stwierdzając podziałów. W związku z brakiem zygot do przenoszenia, przygotowane biorczynie nie zostały wykorzystane.

Kontynuowano badania zmierzające do opracowania metody wprowadzania i integracji egzogennego DNA z genomem kury w oparciu o konstrukty wirusowe jako wektory. Opracowanie a następnie wprowadzenie do tarczki zarodkowej wirusowego konstruktu genowego powinno doprowadzić do wytworzenia ptaka transgenicznego. Opracowaną w 2011 roku lentiwirusową konstrukcje genową zawierającą sekwencję kodującą czynnik CFIII człowieka pod kontrolą sekwencji regulatorowej genu owoalbuminy wprowadzano do tarczek zarodkowych jaj. Zastosowanie w konstrukcji genowej pOVOCFIII promotora genu owoalbuminowego, powinno pozwolić na uzyskanie tkankowo specyficznej ekspresji genu CFIII, ograniczonej do komórek wydzielniczych magnum jajowodu. Produkt białkowy powinien pojawić się tylko w białku kurzych jaj. Efektywną metodą produkcji transgenicznych kur jest wykorzystanie wektorów lentiwirusowych. Zastosowanie w konstrukcji genowej pOVOCFIII promotora genu owoalbuminowego, powinno pozwolić na uzyskanie tkankowo specyficznej ekspresji genu CFIII, ograniczonej do komórek wydzielniczych magnum jajowodu. W wyniku inkubacji jaj po iniekcji lentiwirusowej konstrukcji konstrukcji genowej otrzymano zadowalające wyniki wylęgu - 37,4 %. Dla porównania w grupie kontrolnej procent wylęgu piskląt zdrowych z jaj nałożonych wynosił 53,3%. Obecnie pisklęta są odchowywane i po uzyskaniu przez nie dojrzałości płciowej przeprowadzone zostaną prace polegające na detekcji transgenu.

Powrót do wszystkich tematów

 
© 2008-2017 Instytut Zootechniki PIB (National Research Institute of Animal Production)
Koło Wędkarskie PZW w Oleśnicy pzw.wolesnicy.info - Strona Koła Wędkarskiego w Oleśnicy (świętokrzyskie)
Odpowiedz na wyzwania (konkursy), głosuj, wygrywaj nagrody

Ta strona używa cookies i podobnych technologii. Szczegóły znajdziesz w Polityce Prywatności.