Adres siedziby:
ul. Sarego 2
31-047 Kraków
tel. 12 422 88 52
fax 12 422 80 65
Adres do korespondencji:
ul. Krakowska 1
32-083 Balice k. Krakowa
tel. (Centrala) 12 357 25 00
tel. (Sekretariat) 12 357 27 00
fax 12 285 67 33
Dzisiaj jest: czwartek, 23 listopada 2017 9:59:11
Odwiedziło nas: 8444017 gości (dzisiaj: 792, wczoraj: 2138)
Prace badawcze w 2012 roku

Zadanie 02-5.00.1

"Nowe metody diagnostyki andrologicznej oraz modyfikacje składu mediów na potrzeby konserwacji nasienia samców zwierząt gospodarskich"

Cel zadania

opracowanie i wprowadzenie nowych metod oceny i konserwacji nasienia dla uzyskania bardziej wszechstronnej i pełniejszej informacji o jego zdolności zapładniającej oraz diagnozowania przyczyn zaburzeń płodności

Opis

Zakończono badania, których celem było określenie wpływu dodatku różnych antyoksydantów i białka roślinnego do rozcieńczalników umożliwiających konserwację nasienia w stanie płynnym i mrożonym na poprawę długości czasu przechowywania i jakość nasienia. W pierwszym etapie przeprowadzono badania nasienia pochodzącego od 15 knurów eksploatowanych rozrodowo ZD IZ PIB, Żerniki Wielkie oraz w Stacji Eksploatacji Knurów w Kleczy Dolnej. Nasienie po pobraniu rozrzedzano rozcieńczalnikami: Biosolwens Plus, Biosolwens Plus z dodatkiem L-glutationu, Biosolwens Plus z dodatkiem butylowanego hydroksytoluenu (BHT), Biosolwens Plus z dodatkiem katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej lub Biosolwens Plus z dodatkiem białekj roślinnych i lecytyny sojowej. Po okresie przechowywania w temperaturze +150C, przeprowadzono ocenę ruchliwości nasienia, ocenę zmian apoptotycznych,określono całkowity potencjał antyoksydacyjny plazmy nasienia oraz przeprowadzono ocenę struktury chromatyny plemnikowej. W drugim etapie badaniami objęto nasienie pochodzące od 10 knurów eksploatowanych rozrodowo w Stacji Eksploatacji Knurów w Kleczy Dolnej. Przed procedurą mrożenia przeprowadzono ocenę nasienia w kierunku zmian apoptotycznych, uszkodzeń oksydacyjnych plemników oraz struktury chromatyny plemnikowej. Nasienie rozcieńczano rozcieńczalnikiem żółtkowo-laktozowym, żółtkowo-laktozowym z dodatkiem BHT lub z dodatkiem mieszaniny białek roślinnych i lecytyny sojowej. Procedurę mrożenia nasienia knura przeprowadzono wg metody Westendorfa i wsp., (1975). W oparciu o uzyskane wyniki stwierdzono, że najlepszym komponentem rozcieńczalnika do przechowywania nasienia knura w dodatnich temperaturach jest BHT w stężeniu 0,5 mmol oraz mieszanina białek roślinnych i lecytyny sojowej stężeniu 0,0005g/ml. Natomiast najlepszym komponentem rozcieńczalnika do kriokonserwacji nasienia knura jest BHT w stężeniu 1 mmol oraz mieszaniny białek roślinnych i lecytyny sojowej w stężeniu 0,0005g/ml oraz 0,001g/ml.

Kontynuowano badania, których celem jest określenie stopnia zaawansowania zmian biochemicznych w plemnikach w trakcie konserwacji nasienia królika oraz poprawa efektywności konserwacji nasienia królika w stanie płynnym poprzez wprowadzenie do składu rozcieńczalnika nowych substancji o charakterze osłaniającym. Oceniano wpływ wprowadzenia do składu rozcieńczalnika następujących substancji o charakterze osłaniającym: PMCol (analog witaminy E), Trolox (analog witaminy E), Asolectin (fosfolipidy z nasion soi), BHT (butylowany hydroksytoluen) oraz NAC (N-acetyl cysteina).

Badania przeprowadzono na nasieniu 10 samców. Nasienie dzielono, po czym rozcieńczano poszczególnymi wariantami rozcieńczalnika i przechowywano przez 3 dni w temperaturze 17°C. Codziennie określano aktywność ruchową plemników przy użyciu komputerowego systemu analizy ruchu typu CASA, stan mitochondriów, poprzez pomiar mitochondrialnego potencjału transbłonowego (Δ) przy zastosowaniu barwnika JC-1 oraz przeprowadzano ocenę apoptozy, stosując barwienie z użyciem aneksyny-V znakowanej fluoresceiną oraz oznaczając aktywność kaspazy-3. Stwierdzono korzystny wpływ dodatku troloksu (200µM) i NAC (2mM) na ruchliwość plemników. Żadna z zastosowanych substancji osłaniających nie wpływała na stan mitochondriów i apoptozę plemników w przechowywanym nasieniu.

Kontynuowano badania nad opracowaniem wieloczynnikowej metody oceny nasienia, wykorzystującej wyłącznie cytometrię przepływową jako zaawansowane narzędzie równoczesnej oceny szeregu cech plemników. Badania przeprowadzono na 55 ejakulatach pochodzących od 52 knurów należących do Małopolskiego Centrum Biotechniki w Krasnem (Zakład w Kleczy Dolnej). Dla oceny integralności błon komórkowych i apoptozy, nasienie poddawano badaniu po upływie 3-6 godzin od pobrania. Ocenę fragmentacji DNA plemnikowego przeprowadzano po upływie 24 godzin od pobrania nasienia. Do oceny integralności błon komórkowych zastosowano barwienie fluorochromami SYBR-14 oraz jodek propydyny. Do oceny apoptozy – marker annexin V znakowany FITC oraz jodek propydyny. Dla badań fragmentacji DNA plemnikowego – oranż akrydyny i metodę SCSA (Sperm ChromatuinStructureAssay). Odsetek plemników z fragmentacją DNA był niski i wahał się 0.39% - 6.64% (średnio 1.82%). Stwierdzono 37.40% - 72.70% plemników z nieuszkodzoną błoną komórkową (średnia: 56.15%). Natomiast odsetek plemników apoptotycznych, ze stwierdzoną ekspozycją fosfatydylseryny na zewnętrznej stronie błony komórkowej wahał się 2.03% - 16.47% (średnia: 8.83%). Dotychczasowe prace wykazały dużą wydajność metody cytometrii przepływowej do równoczesnego badania wielu cech danego ejakulatu. Uzyskane wyniki, rozszerzone o kolejne cechy, posłużą do obliczeń korelacji i wyboru najistotniejszych z diagnostycznego punktu widzenia parametrów analizy.

Rozpoczęto badania, których celem jest określenie wpływu uszkodzeń oksydacyjnych plemników knura na stopień uszkodzeń ich błon komórkowych oraz DNA plemnikowego. Powoli to na ocenę oddziaływania rozrzedzalników i czasu przechowywania nasienia na nasilenie uszkodzeń oksydacyjnych. W oparciu o wyniki wstępnych badań, zrezygnowano ze stosowania dwuoctanudwuchloro-fluoresceiny (DCFH-DA) jako markera aktywności wolnych rodników tlenowych z powodu znacznej niespecyficzności znakowania. Jako zamiennik wybrano marker stresu oksydacyjnego żywych komórek CellROX Green (Invitrogen).

Powrót do wszystkich tematów

 
© 2008-2017 Instytut Zootechniki PIB (National Research Institute of Animal Production)
Koło Wędkarskie PZW w Oleśnicy pzw.wolesnicy.info - Strona Koła Wędkarskiego w Oleśnicy (świętokrzyskie)
Odpowiedz na wyzwania (konkursy), głosuj, wygrywaj nagrody

Ta strona używa cookies i podobnych technologii. Szczegóły znajdziesz w Polityce Prywatności.